La operación del servicio TransMilenio es realizada por los transportadores actuales quienes reúnen el 98% de los transportadores de la ciudad. Los operadores de las troncales del sistema son diez empresas que se conformaron para participar en TransMilenio. Estas empresas son SI99 S.A., Express del Futuro S.A., Ciudad Móvil S.A., Metrobús S. A., Transmasivo S.A., SI02 S.A.,Connexión Móvil S.A. Gmóvil, S.A.S, Coobus S.A.A y Consorcio Express S.A.S; los operadores de alimentación son: Alnorte Fase II, Alcapital Fase II, SI 03, Citimóvil, TAO S.A., Gmóvil, S.A.S, Coobus S.A.S Y Consorcio Express S.A.S. 

Estas empresas apoyan y están comprometidas con la reestructuración del transporte público de Bogotá. Las empresas operadoras son escogidas a través de procesos licitatorios abiertos, en los cuales se solicitan estrictos requisitos financieros, legales y técnicos, y se evalúan condiciones que garantizan la mejor selección de acuerdo con los principios de TRANSMILENIO S.A. 
Los adjudicatarios de los procesos licitatorios son los responsables de adquirir los vehículos y contratar los conductores, mecánicos, personal administrativo, y demás operarios. La concesión de la operación incluye la administración de los patios de mantenimiento y estacionamiento, provistos por el Estado. A las empresas operadoras de servicios troncales se les paga en función de los kilómetros recorridos y la tarifa ofertada, de acuerdo con la programación realizada por TRANSMILENIO S.A. El cumplimiento de las condiciones de operación, limpieza y confiabilidad genera estímulos; su incumplimiento genera multas que se aplican a mejorar la supervisión del Sistema.